انجام تلقیح بیولوژیکی موفقیتآمیز، مستلزم انتخاب باکتریهایی با توانایی و تنوع بالا در تجزیهی بسیاری از اجزای فرآورده های نفتی است. نفت سفید حاوی هیدروکربنهای با اندازه کوتاه تا متوسط در محدوده ۸ Cتا ۱۸ Cاست که شامل برخی گروه های آروماتیک از قبیل ان- آلکانها، ایزو- آلکانها و سیکلوآلکانها است (بارسا[۷۶]، ۱۹۸۶؛ سلوموناس[۷۷]، ۱۹۹۰). در نتیجه، باکتری ها به راحتی میتوانند با تجزیه طیف گستردهای از اجزای هیدروکربنی فرآورده های نفتی بر روی منبع کربن رشد کنند. برخی از این گونه ها به طور مؤثر و صحیحی از مواد مغذی و منبع کربن برای تکثیر استفاده می کنند. رشد برخی دیگر، به دلیل غلظت بالای هیدروکربنها و تولید متابولیتهای سمی توسط هیدروکربنهای معدنی متوقف شده و منجر به مرگ آنها می شود.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
اطلاعات زیادی درمورد تجزیه میکروبی هیدروکربنهای خاص وجود دارد که در اغلب متون قابل دسترس است، اما قابلیت تجزیه بیولوژیک برخی فرآورده های نفتی تجاری مانند نفت سفید، کمتر شناخته شده است (سوجییورا و همکاران[۷۸]، ۱۹۹۷). در اغلب منابع در میزان تجزیه هیدروکربنها تفاوتهایی گزارش شده است که به دلیل نوع خاک و منبع هیدروکربن، غلظت کل هیدروکربنها، اکسیژن و در دسترس بودن مواد غذایی است. به طور کلی، هیدروکربنهای نفت سفید بازدارنده برای فعالیت میکروبی نیستند (سونگ و همکاران[۷۹]، ۱۹۹۰؛ آلیون و بردلی[۸۰]، ۱۹۹۱).
پژوهشی در زمینه زیست پالایی بر روی خاکهای آلوده به هیدروکربن در مقیاس آزمایشگاهی با بهره گرفتن از یک پروتکل سادهی دو مرحله ای انجام شد. در مرحله اول از پروتکل، نتایج به دست آمده برای خاک اول نشان داد که فعالیت متابولیکی جمعیت میکروبی بومی بالاست و میزان کل هیدروکربنهای نفتی[۸۱] به میزان ۴۶ درصد کاهش یافت. سنجش خاک دوم نشان داد که میزان فعالیت متابولیکی جمعیت میکروبی بومی پایین و تجزیه بیولوژیکی میزان کل هیدروکربنهای نفتی محدود شده است. اطلاعات به دست آمده از نتایج مرحله اول پروتکل نشان داد که تیمار بیولوژیکی برای خاک آلوده مناسب است. در مرحله دوم پروتکل که ۳۶۰ روز به طول انجامید اقدام به شناسایی مناسب ترین تیمار از طریق ارزیابی شرایط مختلف و مواد افزودنی شد. سنجش میکروارگانیسمها نشان داد که پاسخ خاک اول به تیمارهای مختلف کاهش خیلی زیاد در مقدار میزان کل هیدروکربنهای نفتی بود، در حالی که هیچ یک از تیمارهای اعمال شده برای خاک دوم کاهشی را در میزان کل هیدروکربنهای نفتی نشان ندادند (سابات و همکاران[۸۲]، ۲۰۰۴).
در پژوهشی دیگر توانایی سویههای مختلف بومی (Pseudomonas sp. AP and Pseudomonas sp. CK) علاوه بر برخی از سویههای آلمان (Gordonia sp. DM) برای تجزیه نفت سفید در محیط کشت مایع مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که درصد تخریب نفت سفید در میان موجودات مختلف متفاوت بود و ۹۴-۵۹ درصد از نفت سفید پس از ۲۱ روز تخریب شد. مصرف سبوس گندم، به عنوان سوبسترای مشترک، تخریب مواد نفتی را توسط دو سویه بومی تحریک کرد. در حالیکه گلوگز میزان تخریب را با بهره گرفتن از سه نوع ارگانیسم با مقادیر مختلف مهار کرد. نیترات آمونیوم و اوره، بهترین منبع ازت بودند. استفاده از سوپر فسفات (به عنوان منبع فسفر) در حضور اوره، میزان تخریب را تحریک کرد. همچنین مشاهده شد که علاوه بر سورفاکتانت ۱ درصد، موادی مانند تریتون X-100، Igepal، Tergitol، یا توئین ۲۰ و ۸۰، تخریب مواد نفتی را افزایش داد. استفاده از سلولهای آلی شده کاه و کلش برنج، باعث کاهش زمان تخریب شده و توانایی موجودات زنده را برای تخریب نفت سفید افزایش میدهد.
یافته ها نشان داد که این سه نوع موجود از ۸ درصد نفت سفید حدوداً ۶۵ الی ۸۵ درصد از آن را بعد از ۲۱ روز تجزیه می کنند (مونا و همکاران[۸۳]، ۲۰۰۷).
فصل سوم: مواد و روشها
فصل سوم: مواد و روشها
۱-۳ موقعیت جغرافیایی مناطق آزمایشی
با توجه به اینکه کشاورزان استان خوزستان در طی چند سالهای اخیر برای کنترل علف‌های هرز مزارع سبزی خود از نفت سفید استفاده می‌کنند. این پژوهش در زمستان با نمونهبرداری از مزارع سبزی آلوده به نفت سفید شهرستانهای شوش، دزفول و باوی در استان خوزستان انجام گرفت.
شهرستان شوش بین ۴۸ درجه و ۱۴ دقیقه طول شرقی و ۳۲ درجه و ۱۱ دقیقه عرض شمالی و ارتفاع شهر از سطح دریا ۱۱۲ متر میباشد. میانگین سرمای روزانه در سردترین ماه سال ۲/۴ درجه و در گرمترین ماه سال ۹/۴۵ درجه است میزان بارندگی سالانه بطور متناوب از ۲۴۰ تا ۵۵۸ میلیمتر است.
شهرستان دزفول با ارتفاع ۱۴۰ متر از سطح دریا واقع شده است در طول جغرافیای ۴۸ درجه و ۲۴ دقیقه شرقی و عرض جغرافیایی ۳۲ درجه و ۲۲ دقیقه‌ی شمالی گسترده شده است. این شهرستان مانند بیشتر شهرهای استان خوزستان دارای آب و هوای گرم و شرجی میباشد و تابستانی گرم و زمستانی مدیترانه‌ای دارد. میانگین بارش سالانه باران ۴۰۰ میلیمتر و میانگین دما ۳ درجه سانتی‌گراد در سرد ترین ماه سال و ۴۹ درجه سانتی‌گراد در گرمترین ماه سال میباشد.
شهرستان باوی واقع در ۳۵ کیلو‌متری شمالی‌شرقی اهواز، ارتفاع این منطقه از سطح دریا ۵ متر است. در عرض جغرافیایی ۳۱ درجه و ۳۶ دقیقه شمالی، طول جغرافیایی ۴۸ درجه و ۵۰ دقیقه شرقی قرار دارد. متوسط حداکثر درجه حرارت سالیانه ۲/۴۴ درجه سانتی‌گراد در تیر‌ماه و حداقل آن ۳/۵ درجه سانتی‌گراد در دی ماه و متوسط بارندگی سالیانه ۲۶۴ میلیمتر میباشد. اسیدیته خاک ۴/۷ و درجه شوری خاک ۵ دسی زیمنس بر متر میباشد.
۲-۳ نمونه برداری
نمونه برداری در استان خوزستان و از شهرستانهای شوش، دزفول و باوی انجام گرفت. که در هر شهرستان برای هر گیاه یک مزرعه شاهد و دو مزرعه آلوده به نفت سفید در نظر گرفت شد. نمونههای گیاهی (جعفری، شوید، گشنیز و هویج) به صورت یک گیاه کامل که شامل اندام هوایی و ریشه میباشد. به آرامی از خاک خارج شده، همچنین نمونههای خاک از هر مزرعه به مقدار ۱ کیلوگرم از خاک اطراف ریشه و لابه‌لای ریشه جدا گردید. سپس نمونههای خاک بعد از انتقال به آزمایشگاه، هوا خشک شده، کوبیده و از الک ۲ میلیمتری عبور داده شد و برای انجام آزمایشها مورد استفاده قرار گرفت. نمونههای خاک سپس به آزمایشگاه منتقل و شاخص های نمونههای گیاه بعد از انتقال به آزمایشگاه، و اندازه‌گیری فاکتورهای کمی آنها، مقداری از گیاهان در آون در دمای ۷۵ درجه سانتی گراد خشک گردید و مقدار دیگری از آنها به صورت بافت تازه برای انجام برخی از آزمایش مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۳اندازه گیری شاخص های کمی
اندازه گیری طول ریشه و ساقه توسط خطکش انجام شد. همچنین تعیین وزن تر و خشک ریشه و ساقه گیاهان با ترازوی دیجیتال با دقت انجام گرفت
۴-۳ اندازه گیری پرولین آزاد برگ
برای اندازه‌گیری پرولین از هر گیاه ۲/۰ گرم نمونه تازه از برگ کاملا توسعه یافته در هر تکرار برداشت شد. نمونههای برگ با بهره گرفتن از ۵ میلیلیتر اتانول ۹۵ درصد در هاون چینی کوبیده شده و به وسیله کاغذ صافی محلول صاف گردید عمل استخراج دوبار دیگر و هر بار با ۵ میلیلیتر اتانول ۷۰ درصد تکرار شد. پس از جدا کردن فاز مایع از جامد قسمت مایع برای استخراج پرولین به کار رفت (ایریگوین، ۱۹۹۲). محلول به دست آمده ۱۰ دقیقه در سانتریفیوژ با سرعت ۳۵۰۰ دور سانتریفیوژ گردید. برای تعیین غلظت پرولین از روش بیتس و همکاران (۱۹۷۳) استفاده شد. مقدار ۲ میلیلیتر از عصاره با ۲ میلیلیتر معرف حاوی نین هیدرین اسیدی (۲۵/۱ گرم نین هیدرین در۳۰ میلیلیتر اسید‌استیک خالص[۸۴] و ۲۰ میلیلیتر اسید فسفریک ۶ نرمال) و ۲ میلیلیتر اسید‌استیک خالص مخلوط شده و به مدت ۱ ساعت در حمام آب جوش (۱۰۰ درجه سانتی گراد) قرار گرفت. پس از خارج کردن نمونهها از حمام آب جوش جهت ایجاد شوک حرارتی بلافاصله به حمام یخ منتقل شدند. سپس ۴ میلیلیتر تولوئن به نمونهها افزوده شده و به مدت ۱۵ تا ۲۰ ثانیه به شدت تکان داده تا دو فاز در محلول تشکیل شود پرولین در فاز حاوی تولوئن قرار دارد که در بالای محلول قرار میگیرد. نمونهها ۳۰ دقیقه به حال سکون رها شده تا دمای آن تا حد دمای محیط افزایش یابد. فاز روی که قرمز رنگ است با سمپلر جدا‌سازی شده و جذب با دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج ۵۲۰ نانومتر اندازه‌گیری شد. تولوئن خالص به عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت. برای تعیین غلظت پرولین از منحنی استاندارد تهیه شده با پرولین و بر اساس معادله زیر استفاده شد:
Y= 0.055X + 0.078
عدد قرائت شده از اسپکتروفتومتر، :X مقدار پرولین بر حسب میلیگرم در میلیلیتر
مقدار پرولین بر حسب میلیگرم در میلی لیتر (X) در رابطه زیر قرار داده تا غلظت پرولین بر حسب میکروگرم در گرم وزن تر به دست آید
C (µg.g-1)= X×
V : حجم عصاره (میلیلیتر)، M: وزن نمونه مورد استفاده برای تهیه عصاره بر حسب گرم
۵-۳ اندازه گیری پروتئین
اندازه‌گیری پروتئین با بهره گرفتن از کیت پروتئین کل به روش بیورت انجام شده در این روش پیوند‌های پپتیدی در محیط قلیایی با یون‌های مس دو ظرفیتی تشکیل یک کمپلکس آبی‌ارغوانی رنگ میدهد. شدت رنگ متناسب با مقدار پروتئین در نمونه میباشد کیت مورد استفاده محصول شرکت پارس آزمون، تهران (ایران) بود. ۱/۰ گرم بافت خشک گیاه با ۵ میلیلیتراز عصاره (تریس- هیدروکلرید در ۲۵ میلیمولار و ۶/۷PH=) نگهداری شد. بعد از گذشت ۲ ساعت نمونه به مدت ۱۰ دقیقه در ۲۰۰۰ دور سانترفیوژ شد. در مرحله اندازه‌گیری پروتئین ۲۰ میکرولیتر عصاره و ۱۰۰۰ میکرولیتر از محلول‌های آماده ۱ و ۲ مخلوط شد، پس از مخلوط نمودن نمونهها به مدت ۵ دقیقه در حمام بن ماری (مدل ۵۴ UM) ساخت شرکت پارس آزما، ایران) با دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید. میزان جذب نور در طول موج ۵۴۶ نانومتر توسط اسپکتوفتومتر اندازه‌گیری شد. برای تهیه منحنی استاندارد، از استاندارد پروتئین در کیت استفاده شده و پس از تهیه منحنی استاندارد، معادله زیر تعیین گردید.
Y=.0.013X + 0.005
:Y عدد قرائت شده از اسپکتروفتومتر، :X مقدارپروتئین بر حسب میلیگرم در میلیلیتر
مقدار پروتئین بر حسب میلیگرم در میلیلیتر (X) در رابطه زیر قرار داده تا غلظت پروتئین بر حسب میکروگرم در گرم وزن خشک به دست آید
C (µg.g-1)= X×
V : حجم عصاره (میلیلیتر)، M: وزن نمونه مورد استفاده برای تهیه عصاره (گرم)
۶-۳ اندازه گیری تجمع نیترات
میزان تجمع نیترات در ریشه و شاخساره به روش پیشنهادی کاتالدو و همکاران[۸۵] (۱۹۷۵) اندازه‌گیری شد. مقدار ۱/۰ گرم بافت برگ خشک و پودر شده به مدت ۶۰ دقیقه با ۱۰ میلیلیتر آب مقطر دوبار تقطیر در دمای ۴۵ درجه سانتی گراد عصاره‌گیری شده و به مدت ۱۵ دقیقه در ۱۰۰ دور در ثانیه سانتریفیوژ گردید. مقدار ۲۰۰ میکرولیتر عصاره گیاهی با ۸۰۰ میکرولیتر سالسیلیک اسید۵٪ (محلول در اسید سولفوریک غلیظ) مخلوط گردید (سالسیلیک اسید با نیترات تحت شرایط اسیدی واکنش میدهد به شکل نیترو‌سالسیلیک اسید در می‌آید). سپس محلول به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۴ درجه سانتی گراد نگهداری گردید. پس از آن ۱۹ میلی لیتر سود ۲ نرمال اضافه شد تا pH آن به حد ۱۲ برسد. پس از رسیدن دمای محلول به دمای آزمایشگاه قرائت در طول موج ۴۱۰ نانومتر انجام گردید. برای تهیه منحنی استاندارد از نیتریت سدیم استفاده شده و معادله زیر تعیین گردید.
Y= 0.03X + 0.015
:Y عدد قرائت شده از اسپکتروفتومتر، :X مقدار نیترات بر حسب میلیگرم در میلیلیتر
مقدار نیترات بر حسب میلیگرم در میلی لیتر (X) در رابطه زیر قرار داده تا غلظت نیترات بر حسب میکروگرم در گرم وزن خشک به دست آید:
C (µg.g-1)= X×
V : حجم عصاره (میلیلیتر)، M: وزن نمونه مورد استفاده برای تهیه عصاره (گرم)
۷-۳ اندازه گیری رنگدانههای فتوسنتزی
میزان کلروفیل در برگ بر اساس روش پیشنهادی لیختن تالر (۱۹۸۷)تعیین شد. مقدار ۱/۰ گرم از نمونه برگ به قطعات کوچک تقسیم گردیده و رگبرگ اصلی حذف گردید. قطعات برگ در ۱۰ میلیلیتر استون ۸۰ درصد قرار داده شد و پس از بستن درب ظرف و پوشانیدن ظرف با ورقه آلومینیمی، ظرف حاوی نمونه در تاریکی و دمای ۴+ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد تا کلروفیل برگ خارج گردیده و بافت برگ سفید گردد (در فواصل زمان مختلف تکان دادن ظرف حاوی نمونه انجام گردید) نمونه به مدت ۵ دقیقه در ۳۰۰۰ دور سانتر برای اندازه گیری کلروفیل a وb ، اندازه گیری جذب نور در طول موج‌های ۶۴۶ و ۶۶۳ نانومتر توسط دستگاه اسپکتوفتومتر انجام شد. مقدار کلروفیل a و b بر اساس میلیگرم در گرم وزن بافت مورد نظر محاسبه شد. برای اندازه گیری کلروفیلکل از مجموع میزان کلروفیل a و b استفاده شد.
Chl b (mg/gr) =[11/75 (A645)-2/35 (A663) ] ×۱۰۰/W
Chl b (mg/gr) =[18/61 (A645)-3.96 (A663) ] ×۱۰۰/W
Total = Chla + Chlb
W : وزن نمونه (بر اساس گرم)
A663 : میزان جذب در طول موج ۶۶۳ نانومتر (کلروفیل a)
A645 : میزان جذب در طول موج ۶۴۵ نانومتر (کلروفیل b)
۸-۳ اندازه گیری فلزات سنگین در گیاه
برای تعیین فلزات سنگین گیاه میتوان از دو روش خاکسترگیری تر و خشک استفاده کرد، که در این آزمایش از روش خاکسترگیری خشک استفاده شده است. یکی از مزیتهای این روش به ویژه در اندازه گیری مواد نادر این است که ماده شیمیایی به نمونه گیاهی اضافه نشده و بنابراین احتمال آلوده نمودن نمونه به حداقل میرسد. و برای قرائت عناصر توسط دستگاه جدب اتمی استفاده گردید.
