اتصال

۳۰ ثانیه

به آغازگر مورداستفاده بستگی دارد

گسترش

۳۰ ثانیه

۷۲

۱

گسترش نهایی

۱۰ دقیقه

۷۲

پس از اتمام کار دستگاه ترموسایکلر، محصول واکنش تا زمان انجام الکتروفورز در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
۳-۴-۲-۳ الکتروفورز ژل افقی محصول واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز
جهت کسب اطمینان از تکثیر قطعات دی.ان.ا توسط آغازگر‌ها محصول واکنش روی ژل آگارز یک در‌صد برده شد. بدین منظور ۵ میکرولیتر از محصول واکنش را به همراه ۱ میکرولیتر از بافر بارگذاری x[82]6 مخلوط شد و در چاهک ژل بارگذاری شد. به‌منظور تخمین اندازه‌ی قطعه‌ی تکثیرشده از سایز مارکر bp 100 سینا کلون به میزان ۸/۰ میکرولیتر در کنار نمونه‌های موردبررسی بارگذاری شد و مولد برق الکتروفورز روی ولتاژ ۹۰ و شدت‌جریان ۱۰۰ میلی‌آمپر و قدرت ۵۰ وات به مدت ۵۰ دقیقه تنظیم شد. ولی جهت تفکیک و نمره دهی به باندهای تکثیری از ژل آکریلامید ۸ درصد استفاده شد.
۱-۳-۴-۲-۳ تهیه‌ی ژل آگارز یک درصد
جهت تهیه‌ی ژل آگارز ۱%، ۴/۰ گرم از پودر آگارز را در ظرف ریخته و ۴۰ میلی‌لیتر بافر TBE (تریس بورات) X 5/0به آن اضافه و حرارت داده شد تا آگارز ذوب‌شده و محلولی شفاف به دست بیاید. سپس به‌منظور رنگ‌آمیزی ژل از ۵/۱ میکرولیتر DNA safe stain استفاده شد، به دلیل حساسیت بالای این ماده به حرارت هنگام اضافه کردن آن به محلول ژل تا خنک شدن نسبی آن تأمل گردید. پس از اضافه کردن رنگ، ژل در قالب مخصوص ریخته و پس از بستن ژل، درون تانک الکتروفورز قرار داده شد.
۲-۳-۴-۲-۳ مشاهده‌ی قطعات تکثیرشده
پس از پایان الکتروفورز ژل از تانک خارج و درون دستگاه ژل داک[۸۳] شرکت UVI TEC Cambridge قرار داده شد و قطعات DNA به‌واسطه‌ی تابش نور فرابنفش مشاهده شد و عکس ژل ثبت گردید.
۵-۲-۳ الکتروفورز ژل عمودی
در این تحقیق از دستگاه الکتروفورز دو‌‌قلوی عمودی PEQ lab ساخت آلمان استفاده شد.
۱-۵-۲-۳ تهیه ژل اکریل‌آمید
کل حجم موردنیاز برای یک ژل، ۴۰ میلی‌لیتر و شامل مواد زیر بود:
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

آب مقطر به میزان ۲۴ سی‌سی،
حجم ۸ میلی‌لیتر از محلول TBE 5X (8/107 گرم تریس[۸۴]، ۴۴/۷ گرم Na2EDTA، ۵۵ گرم بوریک‌اسید[۸۵] در یک لیتر آب و ۳/۸= pHبرای TBE 10X)،
میزان ۸ سی‌سی محلول آکریل‌آمید ۴۰ درصد به نسبت ۱۹ به ۱ آکریل‌آمید به بیس آکریل‌آمید[۸۶](در حجم ۵۰ سی سی)،
بیس آکریل‌آمید اتصالات عرضی را در آکریل‌آمید پلی‌مریزه شده ایجاد می‌کند،
میزان ۵۰۰ میکرولیتر آمونیوم پرسولفات[۸۷] ۱۰ درصد (۱/۰ گرم از آن در یک میلی‌لیتر آب دوبار تقطیر)
درست قبل از ریختن ژل، به محلول اضافه شد، این ماده رادیکال‌های آزاد موردنیاز برای پلی‌مریزاسیون ایجاد می‌کند،
میزان ۳۰ تا ۳۵ میکرولیتر TEMED[88] بلافاصله قبل از ریختن ژل برای سریع‌تر بسته شدن ژل به‌عنوان کاتالیزور استفاده شد، هرچه مقدار مورداستفاده بیشتر باشد، ژل سریع‌تر بسته می‌شود اما شکننده‌تر نیز خواهد بود.
تمام مواد اشاره‌شده به‌جز TEMED و APS درون بشر ریخته می‌شوند و پس از اضافه کردن TEMED و APS کمی هم زده‌شده و به کمک سرنگ مخصوص در قالب مخصوص ژل تزریق شد. سپس یک ساعت زمان داده شد تا ژل بسته شود پس‌ازآن شانه‌ها را به‌آرامی خارج نموده و چاهک‌های تشکیل‌شده توسط بافر TBE با سرنگ شستشو داده شد تا قسمت‌های اضافی ژل و بخشی از ژل که پلی‌مریزه نشده باقی می‌ماند کاملاً شسته شوند. در صورت عدم شستشوی کافی درروند حرکت قطعات DNA در ژل خلل ایجاد خواهد شد.
در مرحله‌ی بعد محصول واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز به میزان ۷ میکرولیتر همراه با ۵/۱ میکرولیتر بافر بارگذاری مخلوط و درون چاهک ژل عمودی بارگذاری شد. به‌منظور تعیین اندازه‌ی قطعات DNA از سایز مارکر[۸۹] bp100 به میزان ۸/۰ میکرولیتر استفاده شد.
پس از بارگذاری تمام نمونه‌ها، درپوش دستگاه وصل و مولد با ولتاژ ۱۶۰ و توان ۲۵۰۰ به مدت ۵/۲ الی ۳ ساعت تنظیم شد. پس از اتمام زمان داده‌شده به‌منظور مشاهده‌ی قطعات DNA درون ژل، رنگ‌آمیزی ژل صورت گرفت.
۲-۵-۲-۳ رنگ‌آمیزی ژل اکریل‌آمید
در کلیه‌ی مراحل با بهره گرفتن از آب دوبار تقطیر حجم محلول‌ها به ۶۰۰ سی‌سی رسانده شد و رنگ‌‌آمیزی به‌صورت زیر انجام گرفت:
برای جداسازی ژل آکریل‌آمید، ژل به همراه هر دو شیشه‌ درون محلول تثبیت‌کننده[۹۰] قرار گرفت و به مدت ۲ دقیقه تکان[۹۱] داده شد.
ترکیبات محلول تثبیت‌کننده:
– حجم۶۰ سی‌سی اتانول ۱۰%،
– حجم ۳ سی‌سی اسید‌استیک ۵/۰%،

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...