بخش دوم نام تکنیک یا “الکتروفورز” در واقع به نیروی الکتروموتیوی اشاره می کند که برای حرکت دادن ملکول در درون ژل مورد استفاده قرار می گیرد.مسیر حرکت ملکول های اسیدنوکلئیکی؛ چه RNA چه DNA، در یک میدان الکتریکی بدلیل داشتن بار الکتریکی منفی از قطب منفی به سمت قطب مثبت است. اساس متد معمول به کار رفته برای جداسازی ملکول های اسید نوکلئیکی بر مبنای شکل و اندازه ملکولی آنها می باشد، بنابراین هرچه مولکول‌های اسید نوکلئیکی کوچک‌تر و فشرده تر باشند، سریع‌تر می‌توانند درون ژل مهاجرت کنند.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۱-۳ روش تهیه محلول ها
۳-۱-۳-۱ روش تهیه محلول Tris HCL
Tris-HCL در استخراج DNA ودربافرلیز کننده سلول ها به کار می رود.وزن مولکولی این ماده ۱۴/۲۱ گرم برمول است (M=121/14).بنابراین برای ساخت محلول ۵/۰ مولار ۵۷/ ۶۰ گرم از Tris در ۸۰۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر استریل حل گردید و پس PH با بهره گرفتن از Hcl غلیظ روی ۸ تنظیم گردید و حجم نهایی به یک لیتر رسانده شد.
۳-۱-۳-۲ روش تهیه اتیلن دی آمینو تترا استیک اسید (EDTA)
EDTA در استخراج DNA و بافر لیز کننده ی سلول ها به کار می رود ـ وزن مولکولی این ماده ۲۴ / ۳۷۲ است.بنابراین برای ساخت محلول ۱۰ میلی مولار، ۷۲/۳ گرم از پودر EDTA در ۸۰۰ میلی لیتر آب دوبار تقطیر حل و سپس با بهره گرفتن از مگنت استریل به خوبی همزده شد تا محلول یکنواخت به دست آید. در حین به هم زدن توسط NaOH، PH محلول روی ۸ تنظیم گردید. با توجه به این که انحلال کامل EDTA در PH=8 روی می دهد، بنابراین اضافه کردن NaoH خود به خود به حل شدن پودر EDTA کمک می کند.پس از این که PH در ۸ تنظیم شد، حجم نهایی به یک لیتر رسانده می شود و محلول حاصل در دمای اتاق نگه داری می شود.
۳-۱-۳-۳ روش تهیه محلول کلرور سدیم ۶ مولار (Nacl 6M)
جهت تهیه ی ۱۰۰ میلی لیتر محلول کلرور سدیم ۶ مولار مقدار ۳۱/ ۵۶۴ گرم Nacl درآب مقطر حل گردید و حجم نهایی به ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد، محلول حاصل در دمای اتاق نگه داری می شود.
۳-۱-۳-۴ روش تهیه تریس اتیلن دی آمین تترااستیک (TE)
TE برای حل کردن DNA و نگهداری طولانی مدت آن استفاده می شود. مواد مورد نیاز تا طبق دستور زیر تا حجم ۱۰۰۰ سی سی در آب مقطر حل و سپس اتوکلاو شود.
Tris 1µ(PH=8)(Merck) ………..۱۰ml
Na2 EDTA(0/5M) .………..۲ml
۳-۱-۳-۵ روش تهیه و TAE0 .5X
Tris Base………………………………………………………………………………… ۱۲۱ gr
Glacial acitic………………………………………………………………………… ۲۸/۵۵ ml
ED TA 0/5……………………………………………………………………………… ۵۰ml
– بافر TAE (Tris-Acetate-EDTA buffer) با pH=7/8 به صورت ۵۰X تهیه و مورد استفاده قرار می گیرد.این بافر برای تهیه ژل آگارز و همچنین به عنوان بافر مورد استفاده در تانک الکتروفورز به کار می رود.
مقادیر داده شده دربالا را آماده کرده و PH محلول را چک می کنیم تا حدود ۸ باشد.سپس حجم نهایی را به ۵۰۰ ml می رسانیم . مجددا PH=8 را چک می کنیم و چون غالبا PH اسیدی است آن را توسط بلور سود (NAOH) تنظیم می کنیم.پس از تهیه محلول، از آن TAE با غلظت ۰٫۵X درست کرده به این ترتیب که ۵ml از TAE 50X را با ۴۵۰Ml آب مقطر به حجم ۵۰۰ml می رسانیم.
۳-۱-۳-۶ روش تهیه loading Buffer
نوع و میزان مواد مورد استفاده برای تهیه ترکیب loading Bufferبه قرار زیر است:

Sucrose (40%)………………………..…………………………………………….….…

۴۰ gr

Bromophenol Blue (0.25%)……………………….……………….…………………….

۲٫۵ gr

ترکیب مواد بالا را با بهره گرفتن از آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم. محلول حاصل در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می شود.سپس از محلول حاصل ۵۰۰ ماکرولیتر برداشته به آن ۵۰۰ ماکرولیتر DMSOو۵ ماکرولیتر سایبر گرین وبه میزان بسیار کم(در حد نوک سر سمپلر) برمو فنل بلو اضافه می کنیم سپس محلول حاصل را ورتکس و اسپین می کنیم.
۳-۱-۳-۷روش تهیه SDS ۱۰ درصد
PH محلول حاصل از انحلال ۲۵ گرم SDS در ۱۵۰ میلی لیتر آب دیونیزه استریل را، به کمک سود، به ۲/۷ رسانده، حجم نهایی را با استفاده ازآب دیونیزه به ۲۵۰ میلی‌لیتر می‌رسانیم.نگهداری محلول حاصل به راحتی در دمای محیط امکان پذیر است.
۳-۱-۳-۸ روش تهیه N-lysis
Tris Hcl…………………………………………………………………………….………..۸۵gr
EDTA……………………………………………………………………………………۱/۸۷ gr
SDS……………………………………………………………………………………………۵gr
حجم نهایی مقادیر تعیین شده مواد مذکور را با بهره گرفتن از آب دیونیزه به ۵۰۰ میلی لیتر می رسانیم.
۳-۱-۳-۹ روش تهیه ژل آگارز