مواد و روش ها
۴-۱- مواد گیاهی مورد استفاده
ساقه و برگ گیاه درمنه خزری از مزارع شهرستان ساری تهیه شد.
۴-۱-۱- کشت ساقه
به منظور کشت ساقه از بوته هایی به ارتفاع ۵۰ سانتی متر نمونه تهیه گردید و در پتری دیش های حاوی ۲۰ میلی لیتر محیط موراشینگ و اسکوگ^[۶۳](MS) [107] و ۱۲ تیمار هورمونی از هورمون ها بنزیل آمینو پورین^[۶۴]BAP)) و ۲,۴-D کشت داده شد (جدول ۳-۱).
۴-۱-۲- کشت برگ
به منظور کشت برگ از بوته هایی به ارتفاع ۱۵ سانتی متر نمونه های برگی تهیه گردید و در پتری دیش های حاوی ۲۰ میلی لیتر محیط موراشینگ و اسکوگ (MS) [107] و ۱۲ تیمار هورمونی از هورمون های BAP و ۲,۴-D کشت داده شد (جدول ۳-۱). برای کشت برگ ها در محیط کشت پس از ضد عفونی برگ ها، نمونه های برگی به قطعات حدود cm² ۱ برش داده شد و به منظور کالوس دهی بهتر برگ ها، به کمک اسکالپر خراش هایی روی برگ ایجاد شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۴-۱-۳- تهیه محیط MS به منظور کشت ریشه های مویین
جهت تهیه محیط کشت MS ابتدا استوک های (محلول های ذخیره) مورد نیاز برای تهیه محیط کشت به شرحی که در بند ۴-۱-۳-۱ آمده آماده شده اند (جدول ۳-۲). سپس در یک ارلن به میزان ۵۰ درصد از حجم نهایی محیط آب مقطر ریخته و میزان لازم از هر یک از استوک ها به آن اضافه شد. همچنین هورمون BAP و ۲,۴-D در این مرحله اضافه شد.میواینوزیتول به صورت پودری و نیز ساکارز (۳۰ گرم بر لیتر) به آن اضافه گردید و پس از آن محیطبه حجم رسانده شد. پس از این مرحله pH محیط به کمک اسید کلریدریک و سود ۱ نرمال تنظیم شد. در مرحله بعد ظرف حاوی محیط کشت در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۲/۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو شد. پس از این مرحله توزیع محیط کشت درون پتری دیش ها در زیر دستگاه لامینار صورت گرفت.
۴-۱-۳-۱ طرز تهیه استوک ها
۴-۱-۳-۱-۱- استوک عناصر ماکرو

1. 1. هر یک از عناصر ماکرو محیط MS به اندازه تهیه ۱۰ لیتر محیط کشت وزن گردید.

1. 1. هر یک از مواد وزن شده به صورت جداگانه در مقداری آب مقطر حل شدند.

1. 1. مواد حل شده با هم مخلوط شده و حجم کل آن به ۱ لیتر رسانده شد.

این استوک برای تهیه ۱۰ لیتر محیط کشت کافی می باشد به طوریکه هر ۱۰۰ میلی لیتر از آن برای تهیه ۱ لیتر محیط لازم است [۱۰۷].
۴-۱-۳-۱-۲- استوک عناصر میکرو

1. 1. هر یک از عناصر غذایی میکرو محیط MS به جز آهن (ترکیب آهن با سایر عناصر سبب رسوب دادن استوک خواهد شد) به اندازه ۱۰۰ لیتر محیط وزن شد.

1. 1. هر یک از مواد وزن شده به صورت جداگانه در مقداری آب مقطر حل شد.

1. 1. مواد حل شده با هم مخلوط و حجم کل آن به ۱ لیتر رسانده شد.

این استوک برای تهیه ۱۰۰ لیتر محیط کشت کافی می باشد به طوریکه هر ۱۰ میلی لیتر از آن برای تهیه ۱ لیتر محیط استفاده می شود [۱۰۷].
۴-۱-۳-۱-۳- استوک آهن
استوک آهن معمولا با غلظت ۱۰۰ برابر (برای تهیه ۱۰۰ لیتر محیط) تهیه شد به طوریکه ۱۰ میلی لیتر از آن برای تهیه ۱ لیتر محیط استفاده شد. برای تهیه این استوک دو ماده اتیلن دی آمین تترااستیک اسید (EDTA) به میزان mg 3730 و سولفات آهن به میزان mg 2780 وزن شدند و هر کدام به صورت جداگانه در آب مقطر حل گردید. سپس این دو با هم مخلوط شده و حجم کل به ۱ لیتر رسانده شد. این محلول به نور حساس می باشد به همین خاطر با فویل آلومینیومی پوشانده و در داخل یخچال نگهداری گردید [۱۰۷].
جدول ۳-۲- مواد تشکیل دهنده محیط پایه MS

mg/L

عناصر ماکرو

۱۹۰۰

KNO₃

۱۶۵۰

NH₄NO₃

۳۷۰

MgSO₄.7H₂O

۴۴۰

CaCl₂.2H₂O