نکته: بایستی دقت شود که غلظت TAE بافر تانک با غلظت مورد استفاده آن برای ساخت ژل یکسان باشد و اینکه نباید غلظت بافر بیشتر از ۱X باشد زیرا در آن صورت طبق قانون اهم (V=q X R) مقاومت افزایش یافته و تولید حرارت بیشتر می‌شود که سبب اشکال در روند الکتروفورز و حرکت باند‌ها شده و باعث انتشار[۵۶] باندها وکج شدن آنها می‌شود.

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

میزان ۵ میکرولیتر از محصول PCR، با ۱ میکرولیتر بافر بار کننده ۶X(نسبت ۱ به ۵ ) مخلوط کرده و به آرامی به درون چاهک ژل منتقل­ شد.
جهت محاسبه اندازه قطعات DNA، در چاهک اول از مارکر صد زوج بازی (GeneRuler DNA ladder plus, 100bp) استفاده­ شد. الکتروفورز ژل آگارز با شدت جریان حدود ۹۵ ولت به مدت۵۰ دقیقه صورت پذیرفت. در این مدت زمان، DNA به علت داشتن بار الکتریکی منفی به سمت قطب مثبت حرکت می­ کند. میزان حرکت DNA در بستر ژل بر اساس حرکت رنگ موجود در بافر بار کننده (که مربوط به رنگ برمو فنل بلو می­باشد) ارزیابی­شده بطوریکه در مدت زمان الکتروفورز (حدود۵۰ دقیقه)، حداقل دو سوم طول ژل را طی ­کند. در پایان کار تحت تابش نور ماورا بنفش دستگاه ترانس ایلومیناتور در طول موج۳۲۰ نانومتر، الگوی باندهای DNA نمونه­ها نشاندار و قابل رویت می­گردد.

۱۳-۲-۳- شناسایی کاست ژنی اینتگرون

پس از انجام واکنش PCR برای ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ بر روی نمونه‌های DNA استخراج شده که مقاومت دارویی چندگانه داشتند (MDR) و بررسی وجود یا عدم وجود آن ژنها در محصولات واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با بهره گرفتن از تفکیک محصولات بر روی ژل آگارز، نمونه‌هایی که دارای ژن اینتگراز ۱ بودند، برای بررسی وجود کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرون‌ها و تعیین الگوی باندهای آنها، مجددا با روش PCR با پرایمر های سنتز شده برای کاست ژنی کلاس ۱، مورد آزمایش قرار گرفتند.
نمونه‌هایی که دارای اینتگراز کلاس دو بودند به ۲ علت مورد بررسی وجود کاست ژنی کلاس ۲ قرار نگرفتند:
ترکیب نسبتا ثابت کاست ژنی کلاس ۲ اینتگرون‌ها که در اکثر مواقع حاوی همان ۳ ژن مقاومت کلاسیک خود (مقاومت به استرپتوتریسین، مقاومت به استرپتومایسین/اسپکتینومایسین، مقاومت به تری‌متوپریم) است
دیگر اینکه واکنش PCR با پرایمرهایی که در این پایان نامه و بر اساس منابع و کارهای قبلی برای کاست ژنی کلاس ۲، طراحی شده بود، با غلظت های متفاوت Mgcl2، و تحت شرایط مختلف دمایی، Set up نشد.
جدول۱۴-۳: ساخت محلول کار آماده جهت انجام PCR برای شناسایی کاست ژنی کلاس۱ اینتگرون

مواد
مقادیر حجم برداشتی (میکرولیتر) برای یک واکنش ۵۰ میکرولیتری
آب مقطر(D.W)
۵/۳۳

۱۰X Buffer

۵

Mgcl2(50mm)

۵/۱

Primer F (10µm)

۲

Primer F (10µm)

۲

dNTPs(10mm)

۱

DNA taq polymerase(5u/ml)

۱
جمع
۴۶

* DNA استخراج شده با مقادیر ۴ میکرولیتر به هرتیوب واکنش اضافه گردید.

۱۴-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی کاست‌های ژنی اینتگرون کلاس ۱

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...