پروتئین های غیر ساختمانی پاراکو ویروس ها شبیه بقیه پیکورنا ویروس ها است پروتئین ۳D که RNA پلی مراز وابسته به
RNA است و پروتئین ۳c که یک پروتئاز و از خانواده تریپسین می باشد و مسئول اغلب مکانیسم های شکست پروتئینی در پیکورنا ویروس ها می باشد و فکر می کنند که این دو درگیر در فعالیت های کاتالیتیکی هستند (به ترتیب GxcGGو YGDD) و پروتئین ۲C که فعالیت هلیکازی در پیکورنا ویروس ها داردو به نظر می رسد که همین نقش را در پاراکوویروس ها نیز داشته باشند. در عوض ۳A , 2B , 2A پاراکوویروس ها تشابه کمتری با پیکورنا ویروس های دیگر دارد (۷۶و۸۱).
۱-۱۴-۳) پردازش پروتئین در پاراکو ویروسها:
پردازش پروتئولیپتیک نقش مهمی در بیان ژنهای پیکورنا ویروسها ایفا می کنند بعلاوه پروتئازها نقش های دیگری از جمله,متوقف نمودن سنتز ماکرومولکول های سلول میزبان و ممانعت نمودن از رونویسی , ژن های سلولی بعهده دارند. اولین کلیواژ در پیکورنا ویروسها سریع اتفاق می افتد و منجر به جداشدن پیش سازما نهای ساختمانی و غیر ساختمانی (P1 – P2- P3) می گردد. در انترو ویروسها این عمل توسط ۲A ^pro انجام می شود و انتهای آمینی ۲A کلیواژ می گردد تا پیش سازهای پروتئین های کپسید (P1) جدا گردد. ۲A ^pro درآفتو ویروسها کوتاه می باشد. در این جنس انتهای کربوکسیلی از ۲A کلیواژ می گردد. ۲A در کاردیو ویروسها طویل تر است و با همان روش کلیواژ می گردد. در عوض ۲A هپاتو ویروسها با ۴ گروه قبلی متفاوت است و فاقد خاصیت پروتئولیپتیکی می باشد (۸۲و۸۳).
در افتو ویروسها و کاردیو ویروسها یک پروتئاز دیگر هم وجود دارد که پروتئین L نامیده می شود. این L^proبا اثر خودش از پلی پروتئین جدا می گردد اما در این عمل وجود ۳C نیز ضروری است. فعالیت پروتئولیتیکی پروتئین L را در ردیف ویروس تیپ ۲ اسبی نیز می بینیم (۸۰).
پروتئین L ، ۲A هر یک عملکرد مشخص دارند و با ید در پاراکو ویروس ها هم عمل آن مشخص گردد. در پاراکو ویروس ها یک پلی پپتید کوتاه به طول ۱۲ اسید آمینه پروتئین L را می سازد دقیقاً مانند هپاتو ویروس ها. (۸۰) این قسمت برای میریستیله شدن انتهای N ضروری است و این قسمت در هپاتو ویروس ها فاقد فعالیت پروتئولیتیک بوده است. L^proکه در ابتدای ژنوم کاردیو و آفتو ویروسها قرار دارد خاصیت پروتئازی دارد و خودش را از ابتدای پلی پروتئین آزاد میکند . در ابتدا عقیده داشتند که HPEV₁,₂ دارای L^pro کوتاهی می باشد. این حالت در مورد هپاتو ویروسها نیز پیشنهاد شده بود ولی همه این فرضیات رد شد و معلوم نگردید که تنها کاردیو و آفتو ویروسها واجد L^proدر ابتدای ژنوم خود هستند (۸۰).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

در پاراکو ویروسها تنها ۳C ^pro خاصیت پروتئازی دارد مانند هپاتو ویروسها (شکل۱۸)
(شکل۱۸) کلیواژ اولیه پروتئین پیکورنا ویروسها : در سلولهای آلوده با انتروویروسها و رینو ویروسها با عمل پروتئازی ۲Apro بخش p1 از بخشp2 جدا می گردد. در سلولهای آلوده با کاردیو ویروسها و آفتو ویروسها توسط ۳Cpro اتصال P1-P2 قطع می گردد. در این ویروسها پروتئین ۲A , پروتئاز نمی باشد . اما اتصال خودش(۲A ) با ۲B را قطع میکند. در تمام این ویروسها اتصال P2-P3 با عمل پروتئازی ۳Cpro قطع می گردد. از طرفی در هپاتو ویروسها ۳Cpro اتصال ۲A-2B را نیز قطع می نماید. Lpro در FMDV باعث آزاد شدن پروتئین L از ابتدای ژنوم می گردد.
۱-۱۴-۴) ۵´- UTRدر پاراکو ویروسها :
این قسمت در پیکورنا ویروسها بسیار مورد مطالعه قرار گرفته است و مشخص گردید که ۵´- UTRدر ترجمه پروتئین و همانند سازی RNA دخالت دارد و با انجام موتاسیون در این ناحیه ۵´- UTRمشخص گردیدکه ۵´-UTRدر تعیین سلول هدف و بیماریزایی نیز نقش دارد. در این ناحیه تعدادی از عناصر ساختمان ثانویه و ساختار سوم به چشم می خورد موتاسیون در این نقطه با تغییراتی در پاتوژ نیسیتی همراه می باشد این ناحیه در طبقه بندی پیکورنا ویروسها نیز بکار می رود. تاکنون سه طرح از این ساختار گزارش شده ۱- در رینو وانترو ویروسها ۲- در کاردیو و آفتو ویروسها ۳- در هپاتو ویروسها (۸) (شکل۱۹) نیمه انتهای ´۳ از ۵´- UTR پاراکو ویروسها مشابه نواحی ۵´- UTRآفتو و کاردیو ویروسها می باشد. در این قسمت دومن هایی نظیرساختار چکشی شکل برجسته، نواحی پلی پیریمیدنی و کدون AUG که در شروع ترجمه دخالت دارد موجود است (۸۱و۸۴) .
شکل۱۹: دیاگرام شماتیک ساختار ثانویه
۵´- UTRدر پاراکو ویروس (A) درEMCV (B) و پولیوویروس .© همه پیکورنا ویروسها ۲۰ نوکلوتید پائین دست نقطه شروع (AUG ) واجد Polypyrimidine tract هستند. در کاردیو ویروسها و آفتو ویروسها پس از این ناحیه یک ORF بزرگ وجود دارد; در حالیکه در انترو ویروسها و رینو ویروسها پائین تر از AUG یک توالی دیگر AUG نیز وجود دارد و پس از دومین AUG یک ORF وجود دارد. اتصال کوالانت VPg به ابتدای ۵΄ ژنوم در شکل مشخص است.
۱-۱۴-۵) ارتباط ژنتیکی پاراکوویروسها با پیکور نا ویروسهای دیگر:
با مشخص شدن سکانس ژنومی در پاراکوویروس معلوم شد که ۵´- UTRاین ویروس متفاوت از دیگر پیکورنا ویروس ها است. (در تصویر ۱۶) ارتباط ژنتیکی پاراکوویروس ها را با ویروس های این خانواده بر پایه پروتئین VP₃نشان می دهد. در این قسمت انترو ویروس ها و رینو ویروس ها به همدیگر شباهت بیشتری دارند و پاراکوویروس ها و هپاتو ویروس ها دو دسته کاملاً مجزا هستند که ارتباط مولکولی کمتری با دیگر پیکورنا ویروسها دارند ولی آفتو ویروسها و کاردیو ویروسها در یک محدوده قرار می گیرند (۸و۸۱) .(شکل۲۰)

(شکل۲۰) – دندروگرامی بر اساس پروتئین VP₃در پیکورنا ویروسها.در این تصویر ارتباط ژنتیکی پیکورنا ویروسها و میزان شباهت های بین آنها مشخص شده است.
۱-۱۴-۶) تداخلات بین HPEV₁ و HPEV₂ با سطح سلولهای حساس :
با تعیین توالی ژنوم پاراکو ویروس ها در قسمت انتهای کربوکسیلی پروتئین VP₁یک سکانس ویژه به نام RGD ( آرژنین- گلایسین- اسید اسپارتیک) معلوم گردید (۷۶و۸۰). که در تشخیص سلول میزبان فعال است و این سکانس RGD در تماسهای سلول به سلول و سلول به ماتریکس فعالیت دارد. از این سکانس برای اتصال و ورود پاتوژنها زیاد استفاده می کنند. و در بین پیکورنا ویروسها FMDV و کوکساکی ویروس A₉ که یک انتروویروس است از این سکانس RGD برای ورود استفاده می کنند. RGD در تماس اولیه ویروس با رسپتورهای سطح سلول واکنش می دهد (۱۶و۱۰و۸). (شکل۲۱)
(شکل۲۱)– مقایسه توالی اسید آمینه ای در انتهای کربوکسیلی از VP₁ در بین پاراکوویروسها CAV₉
در HPEV₁ با کمک پپتیدهای سنتتیک واجد RGD می توان این ناحیه را بلوک نمود. از طرف دیگر مشاهده شده که تیپ ۱ برای اتصال به سطح سلول با کوکساکی ویروس A₉ رقابت می کند. گیرنده این دو ویروس همان گیرنده ویترونکتین ( اینتگرین α vβ_۳) است. در مورد کوکساکی ویروس A₉. توالی RGD برای حیات ویروس ضروری نیست و می توان بدون از دست رفتن کامل عفونت زایی این ناحیه را با کمک ایجاد موتاسیون یا هضم با تریپسین تخریب نمود. ولی، حذف توالی RGDدر تیپ ۱ پاراکوویروس کشنده است که این موضوع دلالت بر نقش حیاتی RGD در چرخه تکثیری HPEV₁دارد. (شکل ۲۲)
(شکل ۲۲) نتایج Plaque assay پاراکو ویروس انسانی تیپ ۱ :سلولCHOαvβ۱ (فلاسک A ), سلول CHOαvβ۳ (فلاسک B), و CHOwt (فلاسک C ). سلولهای تخمدان هامستر چینی با پلاسمیدهای حاوی ژن ۱,۲αvβ ترانسفکت گردید و سپس این دو سلول ترانس ژن به همراه سلول وحشی توسط HPEV-1 آلوده شد. تعداد پلاک و مورفولوژی آنها توسط تست Plaque assay مورد ارزیابی قرار گرفت.
عفونت با پاراکو ویروس ها را می توان با استفاده ازAnt α i و Anti β_۱ بلوک کرد و با بهره گرفتن از آنتی بادی) آنتی (MM-Matrix metalloproteinase- 9 به کمترین حد ممکن می رساند (۷۶). در نتیجه پیشنهاد می کنند که ویروس ممکن است از اینتگرینα βاستفاده بکند و معلوم گردید که این تماس بینRGD و اینتگرین αβ برای ورود ویروس ضروری است و این تنها راه ورود ویروس برای داخل به سلول است. در حالی که کوکساکی ویروس A9از دو راه متفاوت با سطح سلول تماس پیدا کرده و داخل می گردد در مورد بعضی گونه های ویروس الزاماً از تماس RGD – اینتگرین αβ برای ورود استفاده می کنند ولی تعدادی از گونه ها توانایی تماس با هپارین سولفات را نیز دارند (۱۰و۸و۷۶).
۱-۱۴-۷) عوارض کلینیکی و اپیدمیولوژی پاراکوویروسها:
HPEV-1 اولین بار در طی یک اپیدمی اسهال تابستانی در سال ۱۹۵۶ ایزوله شد.WHOدر سالهای ۱۹۶۷ تا ۱۹۷۴ ، ۶۰ درصد از عفونتهای تیپ ۱ در کودکان کمتر از یک سال دیده می شود و این آمار در مورد سایر اکوویروسها ۱۵ درصد می باشد (۸۵). میزان گرفتاری CNS در عفونتهای HPEV-1حدود ۱۲ درصد است که این میزان کمتر از عفونتهای انتروویروسی می باشد در حالیکه علائم گاسترو آنتریت (۲۹%) و علائم تنفسی (۲۶%) بیشتر دیده می شود (۸۶و۸۷).
در فنلاند یک مطالعه سرواپیدمیولوژی بر روی ۱۱۰ عفونت انجام شد و معلوم گردید که ۹۵ درصد نوزادان آلوده دارای آنتی بادی علیه HPEV-1 هستند در حالیکه تنها ۲۰ درصد از بچه های بین ۲ تا ۱۲ ماه سرم مثبت می باشند (۸۶). اما درصد افراد سرم مثبت بعد از اولین سال زندگی افزایش می یابد. بطوریکه ۹۷ درصد از بالغین از لحاظ HPEV-1 سرم مثبت هستند که در این میان تنها ۳۰ درصد آنها دارای آنتی بادی علیه اکوویروس تیپ ۳۰ می باشند. این موضوع دلالت بر شیوع زیاد عفونت های HPEV-1 دارد (۱۰).
یافته های خودمان (دکتر قاضی) در ایران نشان داد که مهمترین فصل شیوع در نوزادان کمتر یک سال , فصل بهار و پائیز می باشد و در این مطالعه نشان داده شد که پسر ها بیشتر از دختران دجار علائم بالینی اسهال بودند( ۱۲۴). مهمترین فصل شیوع در تابستان و پاییز است و متداول ترین نشانه بالینی وجود اسهال می باشد و بعد از آن عوارض تنفسی مشاهده می شود و عوارض جسمی به میزان کمتری شیوع داشته است و کمتر آنسفالومیلیت و انواع دیگر عوارض عصبی گزارش گردیده است. ایزوله های تیپ ۲ پاراکوویروس به میزان کمتری شیوع داشته در عفونت با این تیپ از ویروس نیز علائم ناراحتی گوارشی دیده می شود (۹۰و۸۸و۸۹).
۱-۱۴-۸) ویروس های مرتبط با پاراکوویروسها در حیوانات:
در کشور سوئد از یک موش ساحلی اروپایی یک پاراکوویروس جدیدی به نام L jungan virus ایزوله نمودند (۹۱). که موجب میوکاردیت در موش ها می شود و با بررسی سکانس این ویروس معلوم گردید که به جنس پاراکوویروس شباهت داد (۸)، توالی اسیدهای آمینه VP₃ در این ویروس حدود ۷۰ درصد به پاراکوویروس شباهت دارد. قبلاً این توالی فقط در پاراکوویروس انسانی مشاهده شده بود و جدا سازی این ویروس یک نظریه مهم را شدت بخشید که جدا سازی پاراکوویروس از یک موش ساحلی اروپایی دلیل مهمی برای زنونوز (zeonoz)بودن این ویروسها می باشد (۸ و ۹۱).
(شکل۲۳) – ارتباط فیلوژنیک بین پاراکوویروسهای انسانی و ایزوله های تازه جدا شده از ویروس L jungan در حیوانات
(جدول ۳) – میزان تشابه توالی اسیدهای آمینه بین HPEV-1 و HPEV-2
فصل اول
کلیات
(۱-۱بیان مساله:
پاراکوویروس های انسانی یکی از جنسهای جدید خانواده پیکورنا ویروس می باشد. که قبلاً جزء انتروویروس طبقه بندی می شدند ولی اخیراً با تعیین توالی ژنوم و مطالعه مولکولی از این گروه جدا شده و در گروه pev قرار گرفتند. این ویروس کوچک و دارای ژنوم RNA تک رشته ای با قطبیت مثبت می باشد که طول آن از ۷۱۰۰ تا ۸۵۰۰ نوکلئوتید می باشد که داخل کپسید ۲۰ وجهی که از پروتئین های کپسیدی Vpl – Vp4 تشکیل شده است قرار دارند و فاقد غشا می باشند (۹۲، ۹۳ ، ۹۴ ، ۱۰۴).
پاراکوویروس های انسانی از نظر ژنتیکی دارای ۱۴ گروه می باشند و اخیرا تیپ های ۱۵ و ۱۶ توسط obersteشناسایی شده ولی unpub میباشد. تیپ های ۱و۲و۳ آن برای انسان بیماریزا می باشند و علائم آن شبیه انتروویروس های انسانی است آلودگی به پاراکوویروس در همه جای دنیا دیده می شود. پاراکوویروس های انسانی عامل عفونت های مختلف از جمله گاستروانتریت، عفونت های دستگاه تنفسی و بندرت عفونت های دستگاه عصبی مرکزی (انسفالیت، فلج) و ویرمی می باشند (۹۵، ۹۶، ۹۷، ۹۹).
HPEV (پارکوویروس انسانی) اولین بار در طی یک اپیدمی اسهال تابستانی در سال ۱۹۵۶ ایزوله شده بر اساس مطالعات WHO در سالهای ۱۹۶۷ تا ۱۹۷۴، ۶۰ درصد از عفونتهای HPEVدر کودکان کمتر از یک سال دیده می شود و این آمار در مورد سایر اکوویروس ها ۱۵ درصد می باشد )۱۰۹( .در فنلاند یک مطالعه سرواپیدمیولژی بر روی ۱۱۰ مورد عفونت انجام شد و مشخص گردید که ۹۵ درصد نوزادان آلوده دارای آنتی بادی علیه HPEVI هستند در حالیکه تنها ۲۰ درصد از بچه های بین ۲ تا ۱۲ ماهه سرم مثبت می باشند. )۱۱۰( اما درصد افراد سرم مثبت بعد از اولین سال زندگی افزایشی می یابد. بطوریکه ۹۷ درصد از بالغین از لحاظ HPEVI سرم مثبت هستند که در این میان تنها ۳۰ درصد آنها دارای آنتی بادی علیه اکوویروس تیپ ۳۰ (یکی از انتروویروسهای شایع) می باشند. این موضوع دلالت بر شیوع زیاد عفونتهای پاراکوویروس تیپ ۱ انسانی دارد (۱۱۱).
میزان گرفتاری سیستم عصبی مرکزی (CNS) در عفونتهای HPEV حدود ۱۲ درصد است که این میزان کمتر از عفونتهای انتروویروسی می باشد در حالیکه علائم گاستروآنتریت ۲۹ درصد و علائم تنفسی ۲۶ درصد بیشتر دیده می شود (۱۱۰و ۱۱۲). بیشتر عفونتهای HPEV در سنین کودکی و با شیوع فصلی (بیشترین پیک در اواخر تابستان و اوائل بهار) دیده می شود. اسهال مهمترین عارضه کلینیکی در عفونتهای HPEV است که گاهی با علائم تنفسی نیز همراه است. اگر چه گرفتاری CNSدر این بیماران بسیار نادر است ولی مواردی هم از انسفالیت مرتبط با عفونتهای HPEVI گزارش شده است که گاهی اوقات منجر به فلج نیز می شود. عفونت هایHPEVI اغلب با علائم گاستروانتریک همراه می باشند (۹۳ و ۱۱۴).
درسوئدیک پاراکوویروس بنام L junganvirusرا از نژادی از موشهای اروپایی clethrionomysglareolus))ایزوله نمودند (۱۱۵). این ویروس و موش های وابسته به آن در بخش کدکننده پروتئین های کپسیدی خود یک همولوژی با پاراکوویروس ها دارند. بین اسیدهای آمینه پروتئین VP₃در ویروس Ljungan و پاراکوویروس های انسانی حدود ۷۰ درصد تشابه دیده می شود از طرف دیگر ویروس Ljungan واجد یک انتهای آمینی بازی در VP₃می باشد. قبلاً این توالی فقط در پاراکوویروس انسانی مشاهده شده بود. توالی vpo ویروس Ljunganهم به میزان زیادی با پاراکوویروس ها تشابه دارد اگر چه انتهای آمینی آن کوتاه تر است. جداسازی این ویروس در موش دلیلی بر زئونوز بودن ویروس است (۱۱۵ و ۱۱۶).
در گذشته تشخیص آلودگی به پاراکوویروس ها از طریق کشت سلول که وقت گیر بود و آلودگی زیادی ایجاد می گردد صورت می گرفت اما امروزه با تعیین توالی پاراکوویروس ها و بالا رفتن اطلاعات مولکولی و پیشرفت تکنیک های مولکولی با بهره گرفتن از PCR – RT که روشی سریع، حساس و اختصاصی است تشخیص صورت می گیرد (۱۰۷و ۱۰۶و ۱۰۵).
با راه اندازی روش اختصاصی RT – PCR برای تشخیص سریع این ویروس می توان با صرف هزینه و وقت کمتر این ویروس را در نمونه های کلینیکی تشخیص دادو با تشخیص سریع گاستروآنتریت ویروسی از مصرف آنتی بیوتیک بی موردجهت ایجاد مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک جلوگیری می شود.
(۲-۱فرضیه:
۱-بین گاستروآنتریت و پاراکوویروس تیپ یک انسانی ارتباط وجود دارد.
۲- می توان به کمک پرایمرهای اختصاصی طراحی شده بر اساس اطلاعات توالی ژنوم پاراکوویروس تیپ یک، این ویروس را از نمونه های کلینیکی کودکان ایرانی مبتلا به گاستروآنتریت جدا نمود.
۳- توالی ژنوم پاراکوویروسی جدا شده از مدفوع کودکان ایرانی با توالی موجود در Gene bank تطابق دارد.
(۳-۱ هداف تحقیق:
۱-اهداف علمی:
جدا کردن سریع پاراکوویروس انسانی از نمونه های کلینیکی به روش RT- PCR
۲- کاربردی:
با صرف هزینه و وقت کمتر این ویروس ر ا در نمونه های کلینیکی می توان تشخیص داد و با تشخیص سریع گاستروآنتریت ویروسی از مصرف آنتی بیوتیک بی مورد جهت جلوگیری از مقاومت جلوگیری می شود.
(۴-۱ضرورت انجام تحقیق: