s 30

۹۵

واسرشته سازی

s 30

۶۳و۶۱

اتصال

min 2

۷۲

طویل شدن

۱

min 10

۷۲

طویل شدن نهایی

الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
به منظور بررسی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، مقدار۵ مایکرولیتر از محصول واکنش به همراه ۱ مایکرولیتر بافر بارگذاری ۶X مخلوط و به مدت ۹۰ دقیقه با ولتاژ ۱۰۰ ولت بر روی ژل آگارز (پیوست۵-۱-۳) الکتروفورز شد.
خالص‏سازی محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز
به جهت حصول خلوص بالا از محصول حاصل از واکنش مذکور، این عمل را به کمک کیت خالص سازی محصول واکنش PCR تهیه شده از شرکت Bioneer و براساس دستورالعمل شرکت سازنده به جهت ایجاد شرایط مطلوب عمل آنزیم‏های برشی صورت پذیرفت (پیوست۷-۱).
جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز
برای بردن نمونه DNA موردنظر حاصل از واکنش هضم آنزیمی (فرآورده واکنش زنجیره‏ای پلیمراز یا پلاسمید) روی ژل آگارز باید به حجم نهایی نمونه و ظرفیت چاهک توجه کرد، زیرا قطعه‏ای از ژل که جهت جداسازی وخالص‏سازی DNA جدا می‏شود نباید بیشتر از ۱۰۰ میلی‏گرم وزن داشته باشد. زیرا در غیر این‏صورت این عمل به خوبی انجام نخواهد شد. در فرایند خالص‏سازی سعی می‏شود، کوچکترین قطعه ژل که حاوی غلظت زیادی از قطعات DNA مربوطه می‏باشد، جدا شود. غلظت DNA پس از واکنش هضم آنزیمی بسیار تاثیرگذار خواهد بود چرا که اگر غلظت اولیه محصول بالا باشد، درصد بازیابی نیز به طبع آن بالاتر خواهد بود.

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

پس از بردن محصول واکنش هضم آنزیمی روی ژل آگارز و انجام الکتروفورز، ژل به زیر دستگاه uv منتقل شده و محدوده بالا و پایین باند مورد نظر روی ژل توسط اسکالپل تیز و تمیز، با روشن کردن لحظه‏ای uv به سرعت برش زده شده و پس از خاموش شدن uv، قطعه‏ی مورد نظر از روی ژل جدا می‏شود. باید سعی شود که در کوتاهترین زمان ممکن، قطعه مورد نظر را زیرuv برش زده وuv را به‏سرعت خاموش کرد. درعین حال باید توجه شود که تنها قطعه‏ای از ژل که حاوی باند مورد نظر است، جدا گردد و از بریدن ژل اضافی اجتناب شود.
قطعه جدا شده از ژل که حاوی DNA مورد نظر می‏باشد را داخل یک تیوب ۵/۱ میلی‏لیتری استریل قرار داده و سپس بعد از توزین آن، مراحل خالص‏سازی با بهره گرفتن از کیت بازیابی قطعات DNA از ژل آگارز شرکت Bioneer و مطابق روشی که در پیوست (۷-۱) آمده است، انجام گرفت.
هضم آنزیمی با آنزیم‏های محدود کننده تیپ II
غلظت فراورده تکثیر شده یا پلاسمید مورد نظر جهت انجام واکنش هضم آنزیمی با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتروفوتومتر و یا با بردن ۵ مایکرولیتر از آن بر روی ژل آگارز ۱ درصد در کنار مارکر تعیین غلظت لامبدا یا نشانگر وزن مولکولی تعیین می‏گردد. واکنش هضم آنزیمی برای دو گروه محصول، یکی محصول حاصل از واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با Pfu و دیگری محصول واکنش هضم آنزیمی DNA پلاسمیدی به ترتیب، در حجم‏های ۳۰ تا ۵۰ و ۲۰-۳۰ مایکرولیتری انجام گرفت. در اکثر موارد واکنش های هضم به مدت ۴-۳ ساعت در بن‏ماری با دمای ۳۷ درجه سانتی‏گراد انجام گرفت و پس از آن جهت مشاهده باندهای موردنظر و تایید اندازه باند مورد نظر بر روی ژل آگارز ۱% برده شدند. جهت تایید ناقل کلونینگ، واکنش تک هضم آنزیمی، آنزیم‏های برشی XbaI ، SacI برای pGEM و همچنین BamHI و XbaI برای pUC19 در کنار هضم دوتایی با آنزیم‏های مذکور انجام گرفت (جدول های۱۰-۲و۱۱-۲).
جهت تایید ناقل بیانی، واکنش تک هضم آنزیمی، آنزیم های برشی BamHI، XbaI، SacI و هضم دوتایی با آنزیم های برشی (XbaI, SacI)، (XbaI, BamHI) و (SacI, BamHI) طبق شرایط مندرج در جدول (۱۲-۲) انجام شد. فراورده تکثیر و تخلیص شده ژن‏های hrpG وhrpW و ناقل‏های کلونینگ مربوطه طبق جدول (۱۳-۲) و ناقل بیانی طبق جدول(۱۴-۲) با آنزیم‏های XbaI, SacI و XbaI, BamHI هضم شدند. همچنین این عمل با آنزیم‏های مذکور جهت تایید همسانه‏سازی در ناقل‏های کلونینگ و ناقل بیانی نیز انجام شد.
جدول۷-۲- شرایط واکنش هضم ژن hrpW و ناقل کلونینگ مربوطه(pGEM7zf(-)).

اجزای واکنش ژن hrpW ناقل کلونینگ pGEM7zf(-)

محصول PCR/ pGEM7zf(-) µl10،( ng/µl50-40) µl10(ng/µl100-80)

بافرTango X 10 µl3 ،(x1) µl2
آب دوبار تقطیر تا حجم، µl30 تا حجم، µl20
XbaI (u/µl 10) µl1 µl8/0
SacI (u/µl10) µl1 µl1

جدول۸-۲- شرایط واکنش هضم ژن hrpG و ناقل کلونینگ مربوطه(pUC19).