پروتئین معمولاً در ۲۸۰ نانومتر و پلی‌ساکاریدها در ۲۳۰ نانومتر جذب زیادی دارند. بنابراین می‌توان میزان آلودگی محصول به پروتئین و هیدرات­های کربن‌را از طریق میزان این جذب‌ها تشخیص داد.

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

شکل ۲-۳- تصویر بیوفتومتر مورد استفاده در مطالعه حاضر

۶-۳- ارزیابی کیفیت DNA با بهره گرفتن از الکتروفورز افقی ژل آگارز یک درصد

مواد مورد نیاز: بافر TAE با غلظت X10 (تریس استات)، پودر آگارز، بافر سنگین کننده (Loading buffer)، اتیدیوم بروماید ۱%
وسایل مورد نیاز: نمونه‌بردارها، سینی ژل و شانه‌های آن، دستگاه UV، الکتروفورز افقی، دستگاه مستند ساز ژل.
روش ارزیابی:
تانک الکتروفورز ژل شستشو داده شد و خشک گردید.
سینی مخصوص ژل را بر روی مسطح صاف قرار داده و شانه روی ژل قرار داده شده تا چاهک­ها جهت تزریق DNA ایجاد شوند.
برای تهیه ژل آگارز یک درصد ابتدا ۴/۰ گرم پودر آگارز وزن کرده و سپس ۳۶ میلی لیتر محلول TAE (10X) به آن اضافه شد.
سوسپانسیون حاصله را روی شعله حرارت داده تا آگارز در آن حل شود و محلول به­ صورت شفاف درآید سپس ارلن در دمای محیط آزمایشگاه قرار گرفت تا سرد شود.
زمانی که دمای محلول به حدود دمای بدن رسید مقدار ۱۰ میکرولیتر اتیدیوم بروماید ۱% به آن اضافه و محلول کاملا هم زده شد.
محلول را درون قالب مخصوص (سینی ژل) به آرامی ریخته (جهت جلوگیری از ایجاد حباب) و اجاز داده شد تا ژل خود را بگیرد.
بعد از این که ژل خود را گرفت، داخل تانک الکتروفورز قرار داده شد و پس از مدتی (۵ تا ۱۰ دقیقه) شانه ژل به آرامی از ژل خارج گردید.
دو میکرولیتر بافر سنگین کننده را با پنج میکرولیتر از DNA استخراجی مخلوط کرده و در نهایت نمونه­ها را درون چاهک­های ایجاد شده می­ریزیم.
تانک الکتروفورز به منبع جریان برق متصل و ولتاژ دستگاه روی ۷۰ ولت و ۴۵ میلی‌آمپر به مدت ۴۵ دقیقه تنظیم گردید.
پس از انجام الکتروفورز، ژل را از الکتروفورز خارج کرده و درون دستگاه UV قرار داده شد و با بهره گرفتن از اشعه UV، باندهای تشکیل شده مصور شدند و کیفیت و کمیت آن­ها بررسی شد.
شکل ۳-۳- تصویر دستگاه الکتروفورز افقی

۷-۳- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

مواد مورد استفاده: یک واحد بین المللی آنزیم تک DNA پلیمراز، ۵/۱ میلی­مولار کلرید منیزیم ساخت شرکت سیناژن، ۵/۲ میلی­مولار بافر PCR در غلظت X 10 ساخت شرکت سیناژن، ۵۰ نانوگرم DNA استخراج شده، یک میکرومولار از هر یک از نشانگرهای ریزماهواره، آب مقطر استریل تا رسیدن به حجم ۲۵ میکرولیتر.
وسایل مورد استفاده: نمونه‌بردارها با توانایی برداشتن ۱۰، ۲۰، ۱۰۰ و میکرولیتر و میکروتیوپ‌های استریل مخصوص PCR به حجم ۲۰۰ میکرولیتر، دستگاه ترموسایکلر (BIO-RAD, MJ Mini Thermal Cycler, USA).

۱-۷-۳- انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)

۱- برای هر نمونه یک میکروتیوپ ۲۰۰ میکرولیتری استریل انتخاب و شماره نمونه و منطقه آن روی درب آن ثبت گردید. جهت بررسی تنوع ژنتیکی ماهی A. braschnikowi در سواحل دریای خزر از شش جفت نشانگر ریزماهواره AsaD030، AsaD042، AsaC051، AsaC059، AsaD312 و AsaD392 از مقاله انتشار یافته بر روی گونه Alosa sapidissima توسط جولیان و بارترون (۲۰۰۷) در آمریکا استفاده شد (جدول ۱-۴). واکنش زنجیره‌ای پلی مراز در دستگاه ترموسایکلر (BIO-RAD, MJ Mini Thermal Cycler) درون میکروتیوپ­های مخصوص PCR شامل ۵۰ نانوگرم DNA استخراجی، یک میکرومولار از پرایمر (F) و یک میکرومولار از پرایمر ®، ۲/۰ میلی­مـولار از نوکلئـوتیدها، یک واحـد بین‌المـللی تگ DNA پلی مـراز، ۵/۲ میلی­مولار بافر PCR (10X)، ۵/۱ میلی‌مولار کلرید منیزیم و اضافه نمودن آب مقطر پزشکی تا رسیدن به حجم ۲۵ میکرولیتر انجام شد. مراحل انجام واکنش زنجیره­ پلی مراز بدین صورت بود: در واسرشتگی اول، دمای ۹۴ درجه سانتیگراد به مدت سه تا پنج دقیقه اعمال می­ شود و DNA دو رشته از هم جدا می­ شود (Denaturation)، در ادامه ۳۵ چرخه شامل ۴۵ ثانیه در دمای ۹۴ درجه، دمای الحاق دو رشته DNA به مدت ۳۰ ثانیه، ۴۵ ثانیه در دمای ۷۲ درجه و در بسط نهایی سه تا پنج دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی گراد صورت پذیرفت.
۲- محتویات ویال ها توسط سمپلر خوب هم زده و ترکیب شد تا بخوبی همگن شوند.

۸-۳- بهینه سازی PCR

ابتدا با دادن دامنه حرارتی به دستگاه ترموسایکلر بهترین دمای اتصال هر کدام از آغازگرها به رشته الگو به دست آمد و در مرحله بعد جهت تظاهر خوب باندها و حذف باندهای اضافی تکثیر شده، غلظت Mgcl2 بهینه سازی گردید. مقدار Mgcl2 بین ۵/۰ تا ۱ میلی­مولار تغییر داده شد تا بهترین وضوح باندها به­دست­آید.

۹-۳- الکتروفورز محصول PCR، با بهره گرفتن از ژل پلی آکریل آمید ۶%

محصول نهایی PCR با بهره گرفتن از ژل اکریل­آمید ۶% بررسی شد.
مواد مورد نیاز: آب مقطر دو بار تقطیر شده، آکریل آمید، بافر TBE(10X)، آمونیوم پرسولفات، TEMED، بافر سنگین کننده، نشانگر (Ladder) bp100 (ساخت شرکت MBI Fermentase) جهت تعیین وزن آلل­ها.
وسایل مورد استفاده:
دستگاه الکتروفورز عمودی.نمونه­بردار با توانایی نمونه­برداری ۲۰ میکرولیتر.

۱۰-۳- روش تهیه ژل آکریل آمید

در داخل یک بشر ابتدا ۵/۲۳ میلی­لیتر آب مقطر با ۶ میلی­لیتر اکریل­آمید (۳۰ درصد) و ۳ میلی­لیتر TBE(10X) مخلوط شدند. سپس ۵/۲۷ میکرولیتر محلول TEMED و ۲۵۳ میکرولیتر APS به محلول داخل بشر اضافه گردید و به سرعت خوب همگن شدند. سپس محلول نهایی را به فضای محصور بین دو شیشه مخصوص که قبلا تهیه شده بود، به آرامی منتقل گردید تا حباب ایجاد نشود. سپس شانه­های ایجاد کننده چاهک در جای خود قرار گرفتند. پس از بسته شدن ژل (حدود ۳۰ دقیقه) شانه­ها را برداشته و چاهک­ای ایجاد شده را با بافر TBE(1X) خوب شستشو می­دهیم؛ به­گونه ­ای که هیچ ذره­ای از قطعات ژل احتمالی روی چاهک­ها نماند. نمونه­های حاصل از محصول نهایی PCR در موقع تزریق به چاهک­ها ابتدا هر کدام با ۲ میکرولیتر بافر سنگین کننده خوب مخلوط شدند و سپس به ترتیب در محل چاهک­ها ریخته شدند. یکی از چاهک­ها در هر ژل اختصاص به Ladder دارد. ژل در ستون عمودی بافر حاوی TBE(1X) قرار گرفت و با روشن نمودن دستگاه و تنظیم مولد برق آن بر روی ولتاژ ۲۰۰ ولت، الکتروفورز نمونه­ها به مدت ۴ ساعت انجام شد.
شکل ۴-۳- تصویری از دستگاه الکتروفورز عمودی مورد استفاده در مطالعه حاضر

۱۱-۳- رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با روش نیترات نقره

مواد مورد استفاده: آب مقطر دوبار تقطیر، اتانول ۹۶%، اسید استیک، نیترات نقره، NaOH، NaBH4، فرمالدهید.
تجهیزات مورد استفاده: شیکر، ترازوی دیجیتال با دقت ۰۰۱/۰ گرم، ظروف رنگ آمیزی.
روش کار:
بافر A: برای ساخت بافر A، ۴۰ میلی‌لیتر اتانول و ۲ میلی‌لیتر اسید استیک و ۳۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر استفاده شد. بافر B شامل مقدار ۳/۰ گرم نیترات نقره در ۲۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر بود. برای ساخت بافر C، ابتدا ۵/۴ گرم سود را در ۳۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و سپس ۰۳/۰ گرم NaBH4 ۱% به آنها اضافه گردید و در نهایت ۲ میلی‌لیتر فرمالدهید به محلول اضافه شد. برای رنگ آمیزی، به مدت ۷ دقیقه ژل­ها را در بافر A قرار داده، سپس بافر A را تخلیه کرده و ۱۰ دقیقه در بافر B شستشو داده و سپس ژل دو بار در آب مقطر سرد شستشو گردید. سرانجام ژل در بافر C قرار داده شد تا باندها ظاهر شوند. در نهایت بافر C دور ریخته و ژل بین دو ورق پلاستیکی شفاف بسته­بندی شد.

۱۲-۳- ثبت تصاویر

پس از رنگ­آمیزی ژل، تصویر با کیفیتی از آن توسط دستگاه مستندساز ژل (Gel Doc XR, BIO-RAD) تهیه شد. سپس با بهره گرفتن از نرم­افزار ژل پرو آنالایزر Gel pro analyser 3.0. Gene, USA)) وزن باندهای مشاهده شده در باند اصلی در مقایسه با مارکر الگو (Ladder) مشخص گردید. سپس باندهای حاصل در کل نمونه­ها از اندازه کوچک به بزرگ شماره‌دهی شد. بدین ترتیب آلل­های حاصل کدگذاری گردیدند.
شکل ۵-۳- تصویری از دستگاه مستند ساز ژل

۱۳-۳- آنالیز آماری

به منطور محاسبه تعداد آلل در هر یک از جایگاه­های ژنی، هتروزیگوسیتی مشاهده شده و مورد انتظار، شاخص شانون و همچنین آزمون انحـراف از تعادل هاردی- واینبرگ و از نرم افزار GenAlex 6.41 (پیکال و اسموس، ۲۰۰۶) استفاده شد. ظرفیت اطلاعات چند شکلی هر نشانگر با بهره گرفتن از نرم‌افزارver 3.0.3 Cervus به­دست آمد (بوتستین و همکاران، ۱۹۸۰). همچنین جهت بررسی وجود آلل نول، خطاهای دسته‌بندی و یا از دست دادن آلل بزرگ، نرم­افزارMicrochecker 2.2.1 (اوسترهوت، ۲۰۰۴) مورد استفاده قرار گرفت. از آزمون من­ویتنی غیر پارامتریک در نرم‌افزارSPSS ver 19 (زر، ۱۹۹۹) به منظور تعیین معنی­دار بودن اختلاف در مقادیر هتروزیگوسیتی مشاهده شده (Ho) و مورد انتظار (He) استفاده شد. با بهره گرفتن از نرم افزار FSTAT ver 2.9.3 آنالیز غنای آللی، میزان ضریب درون آمیزی (Fis) و سطح معنی­داری آن مشخص گردید (گودت، ۲۰۰۱). میزان تنوع درون و بین منطقه­ای و همچنین میزان تمایز بین مناطق بر اساس معیار مدل آللی بینهایت (Fst) و مدل جهش پله‌ای (Rst) توسط آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) در نرم­افزارGenAlex محاسبه شد (پیکال و اسموس، ۲۰۰۶). همچنین میزان آلل واقعی (Na)، آلل مؤثر (Ne)، جریان ژنی (Nm) و فراوانی اللی[۲۶] نیز در همین نرم­افزار به­دست آمد (پیکال و اسموس، ۲۰۰۶) تست عدم تعادل پیوستگی (disequilibrium linkage) بین جفت جایگاه­های ژنی توسط نرم افزار GENEPOP 3.1 (ریموند و روزت، ۲۰۰۳) صورت پذیرفت. مقادیر فاصله ژنتیکی (D) و شباهت ژنتیکی براساس شاخص نئی[۲۷] (I) با بهره گرفتن از تست مربع لاتین (X2) محاسبه شد (نئی، ۱۹۷۸) و با بهره گرفتن از تست منتل[۲۸]، رابطه بین فاصله جغرافیایی و فاصله ژنتیکی بررسی گردید. همچنین رسم دندروگرام UPGMA در نرم افزار Ver 2.02e NTSYSpc (یه و همکاران، ۱۹۹۹) بر اساس شباهت ژنتیکی به­دست آمده از شاخص نئی صورت پذیرفت.
فصل چهارم
نتایج
۴- نتایج

۱-۴- نتایج حاصل از بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراجی از شگ­ماهی براشنیکوی در مطالعه حاضر

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...