۳-۳-۴٫ غیر فعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه
سوسپانسیون جداسازی شده باکتری سیاه سرفه که واجد سلول های زنده باکتری بودند با بهره گرفتن از حرارت، تحت شرایط خاص ابتدا غیر فعال یا کشته شدند. در این طرح برای این کار از یک دستگاه فرمانتور شیشه ای ۵ لیتری (Novo paljas) با سیستم کنترل حرارت مناسب استفاده گردید. در این روش سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه از طریق مجاری تزریق به محفظه فرمانتور وارد شد سپس با افزایش درجه حرارت داخل فرمانتور از طریق تزریق آب گرم به Heating coil درجه حرارت سوسپانسیون در ۵۶ درجه سانتیگراد بمدت ۱۰ دقیقه نگهداری گردید تا در این درجه حرارت غیر فعال سازی[۱۲۹] باکتری سیاه سرفه انجام پذیرفت و کلیه سلولهای باکتری، غیر فعال یا کشته شدند.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۳-۵٫ سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه[۱۳۰]
از آنجا که سوسپانسیون باکتری جدا شده سیاه سرفه از محیط کشت واجد مقادیری از توکسین­های سیاه­سرفه بویژه پرتوسیس توکسین (PT) است، این مقدار توکسین باید توسط عوامل شیمیایی خاص سمیت زدایی گردد. در این طرح از دو روش مختلف توکسین زدایی با بهره گرفتن از فرمالین و توکسین زدایی با بهره گرفتن از تیومرسال استفاده شد. تا بتوان عملکرد این دو نوعDetoxifier شیمیایی را مورد مقایسه و ارزیابی قرار داد. برای این کار سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه به دو قسمت مساوی تقسیم گردید بخشی از آن تحت تأثیر فرمالین و بخشی دیگر تحت تأثیر تیومرسال مورد سمیت زدایی قرار گرفت.
در روش سمیت زدایی با فرمالین ابتدا به سوسپانسیون، فرمالین اضافه گردید و سپس تحت غیرفعال سازی حرارتی در ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفت. در حالیکه در روش استفاده از تیومرسال ابتدا سوسپانسیون باکتریایی سیاه سرفه در درجه حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه غیرفعال سازی شده سپس به آن تیومرسال اضافه گردید.
۳-۳-۵-۱٫ سمیت زدایی با بهره گرفتن از فرمالین[۱۳۱]
بخشی از سوسپانسیون باکتریایی سیاه سرفه با غلظت متوسط Iou/ ml 150-100 تحت سمیت زدایی با بهره گرفتن از فرمالین قرار گرفت. در این طرح از غلظت mM 10 فرمالین برای این منظور استفاده گردید. در این روش فرمالین مورد نیاز تحت شرایط استریل زیر لامینار به سوسپانسیون باکتریایی اضافه گردید سپس شیشه حاوی سوسپانسیون ابتدا در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه غیرفعال سازی شده، سپس در یخچال ۸-۴ درجه سانتیگراد انکوبه گردید.
۳-۳-۵-۲٫ سمیت زدایی با بهره گرفتن از تیومرسال[۱۳۲]
بخشی دیگر از سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه با غلظت Iou/ ml 150-100 به روش سنتی تحت سمیت زدایی با تیومرسال قرار گرفت. در این روش تیومرسال با غلظت یک در ده هزار (v/w 01/0%) پس از غیرفعال سازی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه در درجه حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰دقیقه زیر لامینار فلو بصورت استریل به سوسپانسیون سیاه سرفه اضافه گردید. سوسپانسیون حاوی باکتری سیاه سرفه و مرتیولات پس از مخلوط شدن در یخچال ۸-۴ درجه سانتیگراد انکوبه گردید.
۳-۳-۶٫ تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه
۳-۳-۶-۱٫ تست استریلیتی[۱۳۳]
برای کنترل استریلیتی، سوسپانسیون سیاه سرفه به دو لوله آزمایش حاوی محیط تیوگلیکولات که محیطی مناسب برای رشد باکتری های بی هوازی است هر کدام یک قطره و به دولوله آزمایش حاوی محیط سویابین کازئین که محیطی مناسب برای رشد باکتری های هوازی و قارچ ها می باشد نیز هر کدام یک قطره از سوسپانسیون باکتری اضافه شد. محیط کشت کازئین سویابین در دمای اتاق و محیط تیوگلیکولات دردمای ۳۷درجه سانتیگراد بمدت۱۴روز انکوبه شدند تا از استریل بودن سوسپانسیون­ها اطمینان حاصل گردید.
۳-۳-۶-۲٫تست کنترل غیر فعال بودن باکتری
یک قطره از سوسپانسیون کشته شده باکتری بر روی دو پلیت محیط کشت حاوی بورده ژانگو تلقیح گردید سپس محیط های کشت تلقیح شده به مدت ۳ تا ۴ روز دردمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. در این تست در پایان هیچگونه رشد باکتری سیاه سرفه در محیط های کشت مشاهده نشد. در غیر اینصورت یعنی باکتری در مرحله غیرفعال سازی کشته نشده است.
۳-۳-۶-۳٫ تست کنترل سمیت زدایی (MWGT)
در این طرح ۲۰ سر موش با وزن ۱۶-۱۴ گرمی بصورت تصادفی در دو گروه آزمایش و کنترل تقسیم شده و سپس قبل از تزریق بصورت جداگانه رنگ آمیزی و توزین شدند. پس از سپری شدن مدت زمان قرنطینه موش ها ۲ ساعت قبل از تزریق ناشتا شده و پس از آن به هر موش از گروه آزمایش بمیزان ۵/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه معادل Iou 8 تزریق و به هر موش از گروه کنترل نیز ۵/۰میلی لیتر سرم فیزیولوژی (NS) استریل بصورت داخل صفاقی (IP) تزریق گردید. ۳ و ۷ روز بعد از تزریق موشها مجدداً توزین شده و اوزان مربوط به هر موش در ستون مربوط به آن موش ثبت گردید.
۳-۳-۶-۴٫ تست توانمندی (تست حفاظتی داخل مغزی موش Kendrick test )
برای انجام این تست ابتدا LD50 سوش حاد باکتری سیاه سرفه (سویه ۱۸۳۲۳) با تزریق داخل مغزی غلظت­های مختلف از آن محاسبه گردید. سپس واکسن های آزمایشی تهیه شده پس از اطمینان از سمیت زدایی آن ها مورد آزمایش توانمندی قرار گرفتند. در این روش دو گروه موش هر گروه متشکل از ۱۶ موش تحت عنوان گروه استاندارد و گروه تست به ترتیب تحت تزریق داخل صفاقی غلظت های ۸/۱، ۴۰/۱ و۲۰۰/۱ از واکسن استاندارد و واکسن آزمایشی قرار گرفتند.
دو هفته پس از واکسیناسیون موش های دو گروه با میزان معادل LD50300 از سوش حاد باکتری مورد تزریق داخل مغزی قرار گرفتند. سپس موش های چلنج شده به مدت ۱۴ روز به صورت روزانه برای مشاهده هرگونه مرگ و میر و یا علائم ناشی از بیماری شامل فلجی، تورم سر و ازدیاد حساسیت به محرک های خارجی مورد بررسی قرار گرفتند. پس از ثبت میزان مرگ در هر گروه میزان نسبی پوتنسی با بهره گرفتن از نرم افزار Combistat محاسبه گردید.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱٫ تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده – ژانگو
از مجموع شش کشت سویه های ۱۳۴ و ۵۰۹ از باکتری سیاه سرفه بر روی محیط بوره-ژانگو محتوی ۲۰-۱۵% خون دفیبرینه گوسفند در تمامی کشت ها کلنی های سوزنی و براق سیاه سرفه بر روی محیط کشت مشاهده گردید. با بهره گرفتن از رنگ آمیزی گرم خلوص هر دو سویه ۱۳۴ و ۵۰۹ باکتری سیاه سرفه با بهره گرفتن از میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی قرار گرفته و در تمامی کشت ها کوکوباسیل های گرم منفی مشاهده و خلوص آنها مورد تأیید قرار گرفت.
۴-۲٫ تهیه بذر در محیط وروی
نتایج حاصل از تهیه بذر در محیط وروی نشان داد که کلیه بذرهای تهیه شده واجد خلوص برای انتقال به فرمانتور بودند.
۴-۳٫ کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن
نتایج حاصل از کشت بچ های شمارهEXMG89-1 ، EXB89-16 ، EXB89-14 ، EXB89-13 ، EXB89-7 وEXB89-3 از سویه ۱۳۴ و بچ های شمارهEXMG89-2 ،EXB89-5 ،EXB89-17 ، EXB89-12 ، EXB89-11 وEXB89-6 از سویه ۵۰۹ نشان داد که میانگین مدت زمان کشت باکتری در بچ های مورد آزمایش حدود ۴۲ ساعت بود. که این مدت زمان کشت در بچ EXB89-5 بالاترین میزان (۵۰ ساعت) خود را نشان داد و بچ EXB89-14 با ۲۷ ساعت کمترین زمان را نشان داد. در ۱۲ بچ مورد آزمایش میانگین pH در هنگام بذر حدود ۷ و در هنگام برداشت حدود ۸ بود.
بطور مثال نمودار تغییرات pH در بچ EXMG89-1 از کشت سویه ۱۳۴ باکتری سیاه سرفه در طول دوره کشت در داخل فرمانتور در نمودار ۴-۱ سیر صعودی تغییرات pH در طول مدت رشد باکتری در فرمانتور را نشان می دهد که از pH 15/7 شروع و به pH 8 ختم می شود (نمودار ۴-۱).
نمودار تغییرات pH در بچ شماره EXMG89-2 از کشت سویه ۵۰۹ باکتری سیاه سرفه نیز در طول دوره رشد سیر صعودی pH را از ۸/۶ به۲/۸ نشان می دهد (نمودار ۴-۲).
نمودار۴-۱٫ تغییرات pH کشت سویه ۱۳۴ از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد در فرمانتور
نمودار۴-۲٫ تغییرات pH کشت سویه ۵۰۹ از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد در فرمانتور
میانگین جرم باکتری در ۶ بچ از سویه ۵۰۹ باکتری سیاه سرفه در هنگام برداشتIou 10930 و بعد از جداسازی Iou 109129 بود و میانگین جرم باکتری در ۶ بچ از سویه ۱۳۴باکتری سیاه سرفه در هنگام برداشت Iou 1095/39 و بعد از جداسازی Iou 109137 بود. اطلاعات مربوط به کلیه کشت های فرمانتوری سویه های ۱۳۴ و ۵۰۹ باکتری سیاه سرفه در جدول ۴-۱ آورده شده است. بالاترین میزان جرم باکتری در هنگام برداشت مربوط به بچ EXB89-14 سویه ی ۱۳۴ با میانگین جذب نوری nm) 530 و ۵۹۰) ۷۳۱/۰ و پایین ترین میزان جرم باکتری در هنگام برداشت مربوط به بچ EXMG89-2 سویه ۵۰۹ با میانگین جذب نوری nm) 530 و ۵۹۰) ۶۹۵/۰ بود که در نمودار ۴-۳ نشان داده شده است.

نمودار ۴-۳٫ مقایسه ی میانگین جذب نوری در طول موج های۵۳۰ و۵۹۰ در مقدار جرم باکتری در هنگام برداشت در بچ های مختلف سویه ۱۳۴ و ۵۰۹
نمودار۴-۴٫ مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×۱) سویه ۱۳۴ در پایان دوره کشت در هنگام برداشت
نمودار۴-۵٫ مقدار غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه (cell109×۱) سویه ۵۰۹ در پایان دوره کشت در هنگام برداشت
با توجه به نمودار ۴-۴ بالاترین میزان غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه در هنگام برداشت در سویه ۱۳۴ با میزان ۱۰۹×۵۶ مربوط به بچ EXB89-14 و پایین ترین میزان ۱۰۹×۲۴ مربوط به بچ EXMG89-1 بود. همچنین بالاترین میزان غلظت نهایی باکتری سیاه سرفه در هنگام برداشت در سویه ۵۰۹ با میزان ۱۰۹×۴۲ مربوط به بچEXB89-6 و پایین ترین میزان ۱۰۹×۴/۱۰ مربوط به بچ EXMG89-2 بود (نمودار ۴-۵).
۴-۴٫ جداسازی باکتری سیاه سرفه ازکشت
برای جداسازی باکتری از دو روش سانتریفوژ و میکروفیلتراسیون استفاده شد. در این پروژه سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با فرمالین در بچ هایEXB89-17 ، EXB89-16 ، EXB89-13 و EXB89-11 توسط میکروفیلتراسیون و بقیه بچ ها توسط سانتریفوژ جداسازی شدند (جدول۴-۲).
همچنین سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه سمیت زدایی شده با تیومرسال در بچ های EXMG89-2، EXMG89-1،EXB89-6 و EXB89-7 توسط سانتریفوژ و بقیه بچ ها توسط میکروفیلتراسیون جداسازی شدند (جدول ۴-۳).
سوسپانسیون حاصل از جداسازی باکتری در هر دو روش (سانتریفوز و میکروفیلتراسیون) با PBS استریل با اسیدیته ۲/۷ مخلوط و رقیق شد و در محدوده Iou/ml150-100 از نظر غلظت باکتری تنظیم شدند.
جدول ۴-۱٫ اطلاعات دوره کشت باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن

No
Batch No.

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...